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成果简介
近日，环境学院贺诗欣教授在环境领域著名学术期刊Water Research上发表了题为“Biotransformation of sulfamethoxazole by microalgae: Removal efficiency, pathways, and mechanis ms”的论文。本文主要研究了小球藻 Chlorella sorokiniana 对磺胺甲恶唑（S MX）的生物降解，全面解析了CYP450酶在S MX代谢命运中的关键作用。此外，通过分子动力学（MD）模拟和密度泛函理论（DFT）计算，揭示了CYP450酶介导S MX代谢的反应性和可行性，从而阐明了CYP450催化S MX的反应机理。总之，本研究阐明了CYP450在微藻细胞内生物降解S MX中的作用，并提高了我们对微藻在废水处理过程中对抗生素生物转化的基本认识。
引言
微藻作为一种可持续的废水生物处理技术，已被证明能有效去除多种抗生素。微藻在去除抗生素的过程中，生物降解和生物吸附是去除抗生素的主要途径。其中，生物吸附主要依赖于细胞壁成分和胞外聚合物（EPS）来提供吸附位点。而生物降解则是通过酶催化母体化合物的发生代谢反应，从而形成代谢中间体。然而，关于微藻中抗生素的生物降解机制尚不清楚，这些相应的驱动酶的确切作用仍处于初始阶段。CYP450是血红素单加氧酶超家族的主要成员，可通过羟基化、脱羧和氧化等将有机化合物催化为活性代谢物。它也被认为是微藻体系中参与抗生素生物降解的关键作用酶。然而，CYP450酶在微藻生物降解中的作用并不明确。到目前为止，只有少数研究基于有限的有机污染物途径推测CYP450的催化过程。关于微藻中抗生素的生物降解机制例如关键催化酶、生物降解中间产物和去除路径仍然存在很大的知识差距。为了填补这一空白，本研究旨在详细研究废水中微藻对抗生素S MX的生物降解行为和代谢，并深入分析CYP450在微藻中的关键催化作用，加速了使用微藻介导的CYP450降解抗生素的发展。
图文导读
微藻中S MX的去除效率及机理
图1：(a) 微藻生物量随时间变化的趋势。(b) L-S MX和H-S MX的总降解率。(c) L-S MX和H-S MX的去除路径的降解率。(d) H-S MX的去除路径百分比。
如图1a所示，对照组与S MX处理组之间的微藻生物量差异并不显著，表明S MX浓度对细胞生长没有明显抑制作用。值得注意的是， H-S MX组可以达到86.57±2.8%的总去除效率，而L-S MX组仅观察到60.36±2.1%的去除效率（图1b），这表明Chlorella sorokiniana对S MX的降解能力取决于细胞代谢活性而不是细胞生物量。为了更好地理解S MX的去除机理，探究了S MX的去除路径。如图1c所示，在非生物对照组下，培养介质不会影响S MX的降解。此外， S MX的光解和水解也可以忽略不计（<1%）（图1d），这清楚地表明生物降解是微藻去除S MX降解的主要途径。与L-S MX组相比，H-S MX组的S MX生物降解率达到80%，是L-S MX组的1.39倍。这种差异可能表明细胞内的酶在降解过程中起着重要作用
CYP450在S MX生物降解中的作用
图2：(a) CYP450活性随时间的变化趋势。(b) L-S MX和H-S MX在第4 day酶活性的比较。(c) S MX和S MX+ABT的生物去除率。(d) S MX和S MX+ABT的去除百分比。
如图2a所示，S MX组中的CYP450活性比对照组中酶活显著增加，这表明CYP450可能是微藻对S MX生物降解代谢的主要功能酶。此外，与微藻生物量不同（图1a），CYP450活性对S MX浓度有高度反应（H-S MX组比L-S MX组高36%；图2b），证实CYP450酶在很大程度上负责降解S MX。为了进一步剖析CYP450酶在S MX生物降解中的作用，我们使用非选择性底物抑制剂1-氨基苯并三唑（ABT）进行了酶抑制实验。添加ABT后，我们观察到S MX的生物去除效率低于未添加ABT的对照组（图2c）。特别是在高浓度S MX下，ABT显著抑制H-S MX的去除效率（14%）（图2d）。因此，我们证明微藻中的CYP450酶在细胞内S MX生物降解中起着至关重要的作用。
微藻对S MX的生物降解途径分析及其中间产物的毒性评估
图3：(a) 微藻对S MX的降解路径。(b) 根据ECOSAR评估S MX和中间产物的急性和慢性毒性。
为了进一步了解CYP450酶参与降解S MX的代谢作用，采用UPLC-QTOF-MS检测了S MX降解途径中的相关转化产物（TPs）。根据S MX的化学结构，微藻中S MX的生物降解主要涉及两条途径：（A）苯胺羟基化和（B）异恶唑开环（图3a）。其中，在途径A中，S MX最初被氧化成亲电中间体，以产生N4-hydroxyl-S MX（A-TP1 m/z 270）产物。N4-hydroxyl-S MX通常与CYP450酶相关，因为它参与了人类肝脏微生物中典型的S MX生物降解过程，也被认为在活性污泥中苯胺的羟基化中起关键作用。值得注意的是，这是首次在微藻中检测到N4-hydroxyl-S MX，这可能会导致更好的S MX生物降解。因为N4-hydroxyl-S MX可能比S MX更具反应性，并且由于其羟基更容易经历进一步的生物降解过程。正如本研究中检测到的PA1-PA3 中的降解产物可以清楚的证明，N4-hydroxyl-S MX作为通过CYP450介导的关键中间体在S MX生物降解中发挥了不可替代的作用。此外，我们使用ECOSAR程序评估S MX及其生物降解中间产物对三种水生物种（鱼类、水蚤和绿藻）的毒性。结果表明，微藻对S MX的生物降解产生的降解产物都可以有效地满足环境评估的实际要求。
CYP450与S MX相互作用的分子观察及其催化机理
图5：(a) CYP450的晶体结构以正面（左）和侧面（右）视图。(b) MD模拟了CYP450在S MX上的催化过程。(c) CYP450和S MX的关键残基能量贡献。(d) CYP450和S MX之间的氢键作用。(e) CYP450和S MX的疏水相互作用。(f)在低自旋状态下，由CYP450反应中心催化的S MX羟基化的关键反应物种自由能分布和优化几何形状。(g) CYP450介导S MX羟基化作用机制。
由于CYP450介导的S MX生物降解的分子机制尚不清楚。为了进一步验证这一点，我们通过分子对接得到的最有利构象被选为MD模拟的代表性构象，以预测了CYP450和S MX之间的潜在代谢位点（图4a）。从图4b可以看出，S MX的苯胺结构倾向于CYP450酶的反应活性中心（Cpd I），表明代谢反应很容易发生。为了更好地解释CYP450和S MX之间的相互作用，我们使用MM/PBSA方法计算了复合物的结合能为-21.61±5.6 kcal/mol，表明S MX可以与CYP450酶紧密结合。在图4c中，CYP450酶的残基分解表明，Lys58、Arg60、Lys73、Val84、Arg168、Thr237和Ala284为-1.17至-7.53 kcal/mol，这对S MX的结合自由能贡献最大。其中，Arg60、Lys73和Val84位于空腔的入口处，通过静电相互作用和范德华相互作用具有很强的亲和力。此外，S MX磺酰基和嘧啶环可以参与Ala72和Arg168中与氨基和胍基的氢键相互作用，距离分别为3.1和3.0Å，这将S MX紧密有效地结合到CYP450（图4d）。另一个与Cpd I氧形成的氢键在S MX催化过程中起着至关重要的作用。同时，观察到烷基原子（Val232、Ala233和Ala284）与S MX的苯环和嘧啶环之间的疏水相互作用，验证了它们对S MX取向的影响，并促进了催化构象。被CYP450酶活性位点包围的其他疏水相互作用残基，如Val69、Gly71、Val84和Leu229，也可以支持有利的S MX催化取向（图4e）。总之，这些结果提供了对CYP450如何与S MX相互作用的理解，明确表明S MX胺上的氮朝向CYP450的Cpd I的方向和可接近性是CYP催化S MX氧化的决定因素。
为了精确探索S MX羟基化的代谢位点和机制，还计算了CYP450对S MX的势能分布和结构（图4f）。结果表明，CYP450的S MX羟基化的主要机制是“反弹机理”（图4g）。反应从反应物络合物（RC）开始，其中从N-氨基中提取的氢原子与Cpd I中的FeIV˭O部分的距离为1.19Å。此外，H-提取途径的过渡状态（TS1）由近似线性N··H··O角（169.4°）确定。中间复合体（IMH）通过H-抽象过渡态（TS1）格式化。然后，在生成IM后，OH自由基从FeIV-OH反弹到基质自由基上。反弹途径的能量屏障（15.8 kcal/mol）显著低于抽氢步骤的能量屏障（-19.3 kcal/mol），表明抽氢在S MX的代谢反应中起着决定性作用。上述计算表明，由CYP450催化的S MX苯胺环的羟基化反应很可能发生，与MD模拟显示的最接近CYP450反应中心（Cpd I）的位置相对应。因此，证明微藻中的CYP450是降解S MX的关键功能酶。
小结
本工作系统的研究了微藻对S MX潜在生物降解机制，明确了CYP450酶在细胞内降解S MX中的关键作用。实验结果表明，S MX在微藻体系中主要发生生物降解，其中CYP450酶活性的明显变化与S MX的生物降解密切相关。根据降解路径中关键的羟基化产物证实了CYP450在S MX代谢中的作用。并从分子角度采用MD和DFT 以解析CYP450介导S MX降解的反应过程。在MD模拟的给定结合模式下，CYP450酶和S MX相互作用可以清楚地表明苯胺环位点易于发生代谢。根据DFT计算表明CYP450对S MX进行的羟基化反应主要是发生反弹机理。本研究为S MX的直接羟基化提供了详细的机理见解，并揭示CYP450酶介导的酶降解途径将为微藻对抗生素降解应用提供有价值的信息。
