广东省科学院土壤所孙蔚旻团队：水稻土中厌氧氨氧化与砷还原的耦联循环，一种全新的生物地球化学过程

近日，广东省科学院生态环境与土壤研究所孙蔚旻团队在厌氧氨氧化与砷还原耦联循环研究方面取得新进展，相关成果以“Anaerobic ammonium oxidation coupled to arsenate reduction, a novel  biogeochemical process observed in arsenic-contaminated paddy soil”为题发表在国际地球化学领域权威期刊Geochimica et Cos mochimica Acta上。该研究成果证明了厌氧氨氧化可与砷还原进行耦联循环，并鉴定了该耦联循环过程中的相关功能微生物，为氮元素和砷元素在环境中的生物地球化学循环过程提供了新认识。

厌氧氨氧化过程最早于1995年被发现，是土壤中氮素流失的主要途径之一。微生物可以亚硝酸盐为电子受体，将铵氧化成氮气。此外，厌氧氨氧化还可以金属元素如Fe(III)、Mn(III)等为电子受体，并产生氮气、亚硝酸盐和硝酸盐等。砷（As）是一种有毒类金属，在环境中主要以三价无机砷（As(III)）和五价无机砷（As(V)）为主要赋存形态，且前者的毒性和迁移性均强于后者。因此，砷还原过程（As(V)→As(III)）可导致砷污染问题的加剧，对人体健康和环境保护均产生威胁。值得注意的是，砷还原与铁还原具有一定的相似性，如均可利用有机质、还原性硫、甲烷等为电子供体。因此，我们推论砷还原可能与铁还原类似，也可与厌氧氨氧化过程相耦合。且从热力学上讲，砷还原具有与厌氧氨氧化耦联循环的潜力。但目前关于该耦联循环的研究尚处空白。因此，本文旨在寻找厌氧氨氧化可与砷还原进行耦联循环的证据，并探究其中的关键功能微生物。

砷污染水稻土是砷还原与厌氧氨氧化发生的热区，是探究砷还原与厌氧氨氧化是否可进行耦联循环的天然实验点。因此，本项目以砷污染水稻土为研究对象，以13C15N-尿素为底物，通过同位素标记技术结合室内微宇宙培养技术，开展关于砷还原与厌氧氨氧化的耦联循环的研究。研究表明，添加As(V)可显著提高水稻土中15N-N2（29N2和30N2）的产量（图1）。这说明，砷还原过程促进了水稻土中的厌氧氨氧化过程，即厌氧氨氧化可能与砷还原进行耦联循环（Asammox）。在同时添加As(V)和厌氧氨氧化抑制剂C2H2的处理组中，仍有显著的29N2和30N2产生（图1）。这也从另一个角度说明，水稻土中可能存在与砷还原相耦联的厌氧氨氧化过程。

hzsB和arrA基因分别是厌氧氨氧化和砷还原过程的关键功能基因。因此，本项目对hzsB和arrA基因进行定量分析。结果发现，hzsB和arrA基因均在添加As(V)的处理组中显著增加，且显著高于未添加As(V)的处理组（图2）。这说明，hzsB和arrA基因可能是厌氧氨氧化耦联砷还原过程中的关键功能基因。hzsB基因在未添加As(V)的处理组中亦显著增加，说明水稻土中同时也有厌氧氨氧化过程（Anammox）发生。这与上述15N-N2产量的相关分析结果是一致的。

根据上述结果，我们以hzsB为目标基因，利用DNA-SIP技术，鉴定水稻土中厌氧氨氧化耦联砷还原过程中的关键功能微生物。结果发现，在添加As(V)和13C15N-Urea的处理组中，hzsB基因在培养第10天向重区发生明显聚集，而在未添加As(V)的处理组中此现象则不明显（图3）。这也再次证明了，hzsB基因是厌氧氨氧化耦联砷还原过程中的关键功能基因。

根据上述结果，我们回收13C处理组（As(V)+13C15N-Urea，13C15N-Urea和As(V)+13C15N-Urea+C2H2）的重层DNA和12C处理组（As(V)+12C14N-Urea）的轻层DNA，并对其进行细菌和厌氧氨氧化菌16S rRNA基因的高通量测序分析。细菌16S rRNA基因的高通量测序结果发现，在添加As(V)的13C处理组（As(V)+13C15N-Urea和As(V)+13C15N-Urea+C2H2）的重层DNA中，Halomonas，Pelagibacterium和Chelativorans的丰度显著增加（图4），说明它们很可能是驱动厌氧氨氧化耦联砷还原过程的关键功能微生物。厌氧氨氧化菌16S rRNA基因的高通量测序结果则发现，Ca. Brocadia在所有处理组中均占有主导地位（73-100%），尤其在添加As(V)的13C处理组（As(V)+13C15N-Urea和As(V)+13C15N-Urea+C2H2）的重层DNA中，其丰度高达95-100%（图5），这说明Ca. Brocadia是水稻土中关键的厌氧氨氧化菌。