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浙大俞萍锋-东华李响-莱斯Pedro Alvarez团队:基于噬菌体的环境生物膜控制技术

2022-11-28 09:11:28 来源:浙大俞萍锋-东华李响-莱斯团队

成果简介

浙江大学环境与资源学院俞萍锋研究员团队,东华大学环境科学与工程学院李响教授研究团队和莱斯大学Pedro Alvarez院士研究团队对基于噬菌体的生物膜控制技术开展了系统深入的研究,并取得了技术突破,近期在环境领域著名期刊Environmental Science & Technology上发表了两篇文章。Pedro Alvarez院士团队和俞萍锋研究员团队,从污泥中筛选分离出高效杀灭生物膜常见菌种的多价烈性噬菌体,对M13噬菌体进行基因编辑以增强其对模式生物膜和多价烈性噬菌体的亲和力,并通过肽链亲和性构建M13噬菌体和多价烈性噬菌体的偶联复合体,该复合体在静止或低流速状态下能高效去除水管模拟装置中的模式生物膜。李响教授团队和俞萍锋研究员团队,探究了不同等离子体放电时间下内源前噬菌体的激活效率,阐明了等离子体放电作用下微生物内部氧化应激机制以及表面结构变化,揭示了内源噬菌体激活作用下细菌灭活及生物膜控制分子机制,提出了等离子体放电作用下产生的活性自由基是实现内源噬菌体激活的重要因子。

引言

生物膜是城市水处理及输送系统中普遍存在的问题,它主要是由微生物以及代谢产生的胞外聚合物(EPS)而形成的微生物聚合体。传统以化学消毒剂为主的生物膜控制技术会产生大量消毒副产物,同时会加速管道等基础设施的腐蚀。因此亟需开发一种有效且可持续的生物膜控制技术。

噬菌体(特异性侵染细菌的病毒)作为一种环境友好型且能自我复制的杀菌剂,其在生物膜控制上的应用近年来引起人们的关注。噬菌体可以侵染、裂解常见的生物膜细菌;且一些噬菌体能生产解聚酶以促进其在生物膜内的渗透和EPS基质的降解,加速生物膜的清除。在流动系统中,噬菌体靶向清除生物膜极具挑战性。噬菌体的作用效率取决于其对生物膜的亲和力——对于流栋系统中靶向吸附至生物膜至关重要,以及其在生物膜内的扩散能力——决定噬菌体繁殖和生物膜根除速率;然而同一株噬菌体所呈现出这两种能力往往呈负相关。

因此,Pedro Alvarez院士团队和俞萍锋研究员团队的这项研究旨在将具有高扩散能力和细菌裂解能力的野生多价烈性噬菌体和经过改造具备高生物膜亲和力的商用M13噬菌体,通过噬菌体展示技术构建为复合体。该复合体应同时具备高亲和力和高扩散性,以期提高其在水管模拟装置中,对Pseudomonas aeruginosa - Escherichia coli双物种生物膜的清除效率。

基于外源烈性噬菌体投加的生物控制策略由于目标细菌未知以及噬菌体传递效率低的问题,其有效性而受到阻碍。然而通过施加一定的环境压力激活潜伏在细菌体内前噬菌体进入裂解周期,由此引发的噬菌体增殖可实现生物膜内细菌裂解和生物膜清除,从而克服传统噬菌体策略的技术障碍。等离子体作为一种环境友好、无二次污染的绿色高级氧化技术,可以产生大量的活性自由基从而对细菌产生氧化压力,使细菌DNA遭受氧化损伤。而细菌DNA的破坏以及相关的SOS反应是触发前噬菌体激活的关键。以前的研究主要集中利用高强度大气压低温等离子体(Cold atmospheric plas m, CAP)直接氧化生物膜外部的细菌。然而,并不清楚低强度CAP(low-intensity CAP, LICAP)是否能激活前噬菌体,从而以一种新的 “由内向外” 的策略裂解细菌。

因此,李响教授团队和俞萍锋研究员团队以E. coli (λ+)和E. coli(λ-)为研究对象,旨在探究LICAP作用下微生物的氧化反应机制,揭示实现前噬菌体激活的重要活性物种,优化其使用以及扩大基于CAP的微生物控制。

图文导读

一、莱斯大学-浙江大学研究成果

首先,用纳米磁珠CNCs从活性污泥中分离多价噬菌体。该CNCs为胺官能化的铁碳化物(Fe3C-NH2),并用万古霉素(Vancomycin)和PEG包被以增强与细菌的附着(图1)。被该纳米磁珠附着的细菌成为磁性细菌,我们将其加入从活性污泥提取出的噬菌体池中,使用序贯多宿主方法分离出三株能侵染P. aeruginosa和E. coli的多价噬菌体,命名为PEBX、PEBY和PEBZ。

构建磁性细菌用于噬菌体的筛选分离

图1. 构建磁性细菌用于噬菌体的筛选分离。

多价噬菌体PEBX属于长尾噬菌体科,PEBY和PEBZ属于肌尾噬菌体科(图2a)。它们对悬浮态的P. aeruginosa PAO1细胞和和E. coli NDM-1细胞均表现出高效的侵染和裂解(图2b)。此外,使用固定相P. aeruginosa和E. coli菌苔进行噬菌斑测定,在20小时培养后,PEBX、PEBY和PEBZ的噬菌斑直径分别为2.07±0.06mm、0.15±0.01mm和1.80±0.10mm(图2c)。这表明PEBX具有较高的分散性,并能在营养有限的条件下(如菌苔中和性质类似的成熟生物膜中)实现高效繁殖。因此,我们选择PEBX进行后续噬菌体偶联复合物的构建和管网中生物膜的清除实验。

从污泥中分离出的多价噬菌体PEBX、PEBY和PEBZ的相关表征

图2. 从污泥中分离出的多价噬菌体PEBX、PEBY和PEBZ的相关表征。

M13噬菌体可以通过基因编辑在其表面蛋白中插入短肽链,从而改变表面蛋白的亲和性,这一技术被称为噬菌体展示技术。我们先对M13噬菌体的pVIII表面蛋白进行改造,使其对生物膜具有高亲和性。在生物膜识别和附着的目标选择上,我们没有选择生物膜基质的主要成分——胞外聚合物(EPS),因为EPS的结构和成分高度可变,并受到周围条件(如温度、氧气、化学污染物、营养物质)和生物因素(如细胞类型、细胞生长阶段、生物膜形成阶段)的显著影响。我们选择的吸附目标是P. aeruginosa,因为与生物膜EPS相比,它具有相对稳定的细胞表面结构。P. aeruginosa是饮用水管网系统中常见的条件致病菌,因为高繁殖率、排他性等特点,它成为了研究中所用的双物种生物膜(以及在不同环境中的其他多物种生物膜)的主要菌种,因此易于被噬菌体识别、吸附。我们从多肽库中获得了3种对稳定生长期的P. aeruginosa具有高亲和力的多肽:YHLPVES,FSPGSVR和ASWIAVR。其中,只有YHLPVES被成功融合到pVIII中进行展示(图3a和b),其余两个多肽融合展示失败的原因可能是其导致pVIII结构和M13活性受损。

M13噬菌体的编辑和肽链展示

图3. M13噬菌体的编辑和肽链展示。

为证实肽融合和展示的益处,我们评估了该pVIII修饰(即肽链融合展示)的M13噬菌体对P. aeruginosa悬浮细胞的吸附。噬菌体和细菌混合培养10分钟后,pVIII修饰的M13对P. aeruginosa的吸附效率为97±1%,之前筛选出的多价烈性噬菌体PEBX对P. aeruginosa的吸附效率为28±6%,而野生型M13噬菌体几乎不吸附(吸附效率为5±2%)(图4a),这证实了肽链YHLPVES的融合展示大大增强M13噬菌体对P. aeruginosa的亲和力。且实验表明,pVIII修饰的M13噬菌体是与P. aeruginosa细胞表面的多糖结合而不是蛋白质(图4b)。值得注意的是,多糖是包括P. aeruginosa在内的大多数革兰阴性菌荚膜和黏液的主要成分。此外,多糖是占细胞壁组分75%的LPS分子的最外层结构。因此,筛选出的吸附P. aeruginosa的多肽,其亲和力位点是多糖而不是蛋白质是合乎概率逻辑的。此外,相较于PEBX和野生型M13噬菌体,该pVIII修饰的M13对本研究中选用的双物种生物膜的结合效率有显著提高。在饮用水管道运行模拟实验中,约40%修饰后的M13噬菌体从水流中被吸附到生物膜上(总活菌密度约为108CFU/cm2);PEBX的吸附效率约为7%,未观察到野生型M13噬菌体的显著吸附(图4c)。pVIII修饰后的M13噬菌体在其表面展示出约2700个YHLPVES肽链,使得其能高效结合悬浮状态和生物膜状态下的P. aeruginosa。

pVIII修饰后的M13噬菌体对P. aeruginosa细胞和生物膜的亲和力显著提高

图4. pVIII修饰后的M13噬菌体对P. aeruginosa细胞和生物膜的亲和力显著提高。

肽链YHLPVES可以提高M13噬菌体与生物膜的亲和性,但还需要提高M13对多价烈性噬菌体PEBX的亲和性,以将其靶向传递到生物膜上。我们筛选出了5条对PEBX高度亲和的肽链,HDYTDWYWLLSY、LTSSNQS、WHWYQFELPDVV、SNPETPDRPFRH和QGPTQFN(图3c),并使用基因工程手段将它们分别融合展示在M13噬菌体的pIII尾丝蛋白上(图3b)。获得的M13噬菌体其pVIII蛋白和pIII蛋白均被修饰,称为双重修饰M13,根据融合进pIII蛋白的肽链的不同,分别被命名为III-1到III-5。理论上,双重修饰的M13噬菌体与PEBX会因肽链的亲和性而自发结合,但如果M13与PEBX的尾部结合,会阻碍PEBX识别宿主受体从而显著降低PEBX的感染性。因此,我们将PEBX和III-1到III-5分别偶联复合(107 PFU/mL PEBX和107 PFU/mL M13混合),发现它们对于生物膜中活菌的清除效率分别为79±5%、42±13%、19±5%、78±4%和61±7%,而相同条件下PEBX的单独作用处理仅使生物膜活菌数减少19.1±7.8%。因此,我们选择PEBX与双重修饰的M13噬菌体III-1(pIII融合的多肽链序列为HDYTDWYWLLSY)的偶联复合物来对水管中的生物膜进行控制。二者之间的有效偶联也被荧光实验所证实。具体而言,PEBX-CNC复合物放射出绿色荧光(SYBR-gold染色PEBX),PEBX-CNC复合物在与携带红色荧光的III-1混合后,也显示出红色荧光,这表明修饰后的M13噬菌体有效附着在PEBX-CNC复合物上(图5a)。此外,III-1对CNCs单体没有表现出亲和力(图5b),只经pVIII修饰的M13也没有吸附PEBX-CNC复合物(图5c),这证实了M13噬菌体亲和力的增强是由融合到pIII的多肽引起的。

双修饰的M13噬菌体III-1会通过肽链亲和性与PEBX(固定于CNCs上)相偶联

图5. 显微镜下的荧光实验验证了双修饰的M13噬菌体III-1会通过肽链亲和性与PEBX(固定于CNCs上)相偶联。

水流动力条件会影响噬菌体对细胞的侵染,因而会影响饮用水管网系统中噬菌体对生物膜的处理效率。在静止状态下(即流速为0,常见于储水罐和某些末端管网),PEBX处理导致水管中生物膜活菌数减少了16±12%,总菌数减少了12±5%(16S rRNA基因定量检测);使用噬菌体偶联物处理致使活菌减少77±7%,总菌减少75±11%(图6a)。流速为0.01cm/s时,PEBX处理使生物膜内活菌数减少了34±6%,总菌数减少了28±8%;噬菌体偶联物依然表现出更高的生物膜控制效率,使活菌数减少了84±5%,总菌数减少了78±4%(图6a),且由于活菌的裂解,活/死细胞比率显著下降(图6b)。生物膜去除效率的提高是由于M13的偶联物增强了PEBX对生物膜的亲和,从而有利于细菌侵染和裂解;此外,相较于PEBX,噬菌体偶联物更大幅度地下调了EPS合成基因、卷曲菌毛合成相关基因和群体感应相关基因的表达,从而促进生物膜溃散、防止膜再生。

流速增加可以促进噬菌体与细菌的接触,但也产生了更大的剪切力,易使噬菌体在完成DNA注射前就从宿主细菌上脱离。因此,在0.01cm/s至1cm/s流速范围内,PEBX处理和噬菌体偶联复合物处理的生物膜去除率均与流速呈负相关(图6a)。由此可见,噬菌体偶联物对生物膜的清除在静止体系或低流速系统中最为有效,如储水罐和建筑物内部管道这类最容易受到微生物污染的饮用水管网区域。噬菌体偶联物可以在生物膜上游通过blow-off和hose bibbs等加入管道中,因PEBX和M13均未对水箱或管道的常用材料(如玻璃纤维、高密度聚乙烯(HDPE)和聚氯乙烯(PVC)等)表现出显著吸附,因此偶联物不会滞留在水箱或管道表面,可有效运输至目标生物膜达到杀灭目的。

噬菌体偶联复合物能更高效地清除水管模拟装置中的生物膜

图6. 噬菌体偶联复合物能更高效地清除水管模拟装置中的生物膜。

二、东华大学-浙江大学研究成果

在不同LICAP处理时间后,E. coli (λ-) 的生长速率显著高于E. coli (λ+)且两者显示出不同的生长模式(图1A和图1B)。E. coli (λ-) 的生长速率在LICAP处理10min后略微上升,随着处理时间增加,E. coli (λ-) 的生长逐渐受到抑制。然而,E. coli (λ+) 的生长速率随着处理时间增加呈现“U”形曲。LICAP处理30min后,其生长速率受到显著抑制,相对空白组下降了92%。相应地,诱导的活性噬菌体数量随处理时间增加呈现倒“U”形。具体来说,处理时间从10min增加到20min时,诱导的活性噬菌体的数量从1.60×105增加到6.80×105PFU/mL。然而,继续延长处理时间导致活性噬菌体数量持续下降,在50-min LICAP处理后下降到0.12 × 104 PFU/mL。

LICAP激活前噬菌体lambda(λ)抑制E. coli(λ+)的增殖

图1. LICAP激活前噬菌体lambda(λ)抑制E. coli(λ+)的增殖

LICAP对E. coli 的混合培养物的生长速率的抑制效果显著高于E. coli (λ+) 纯培养物(图2A)。此外,E. coli 混合物中的活性噬菌体数量比E. coli (λ+)培养体系中高1.44倍(图2B)。由于生物膜的复杂结构以及EPS基质的保护,生物膜内的细菌通常表现比浮游细菌更强的抵抗力。但是结果显示,LICAP通过激活前噬菌体,也能实现生物膜状态下E. coli (λ+)以及E. coli混合培养物的有效灭活。经LICAP处理后,E. coli (λ+)和E. coli 混合生物膜的生物量分别下降了40%和46%,E. coli(λ-)生物膜中的生物量增加了(图2C)。同样地,E. coli (λ+)和E. coli 混合生物膜也释放出大量子代噬菌体 (图2D)。这些结果证实了LICAP在浮游状态以及生物膜状态下的E. coli混合培养物了级联效应:LICAP处理激活了E. coli (λ+)中的λ噬菌体,进而裂解E. coli (λ+)并释放大量子代噬菌体,释放的噬菌体感染并裂解了周围易感的E. coli (λ−),从而产生更多的噬菌体。总体而言,LICAP通过激活溶源菌内的前噬菌体,并通过“由内而外”的策略实现生物膜控制,可以避免传统消毒剂策略(如抗生素和消毒剂)中由外而内的扩散限制。

LICAP激活前噬菌体lambda(λ)实现细菌灭活和生物膜清除

图2. LICAP激活前噬菌体lambda(λ)实现细菌灭活和生物膜清除

细胞内基因组的不稳定性对前噬菌体的激活至关重要,这个过程一般与细胞内ROS的积累有关。在LICAP处理后,对细胞内ROS水平进行监测(图3A)。短时间的LICAP暴露(即10min与20min)略微增加了细胞内的ROS水平,而延长暴露(30min)使细胞内的ROS水平增加了184%。随着细胞内ROS浓度的增加,抗氧化酶(SOD、CAT)的活性也随之增加,以清除细胞内ROS,而细胞内ROS的积累进一步促进细菌抗氧化酶系统的崩溃(图3B)。细胞内的ROS水平在较长时间的暴露后(40min 和50min)下降,可能是由于大量的细菌被裂解和细胞内ROS释放。随着LICAP处理时间的延长,CAP诱导的膜脂质氧化程度增加(图3C)。此外,LDH释放和蛋白质渗漏持续增加,与细胞表面破坏的加剧和渗透性的增加相一致(图3D)。细胞膜破坏以及渗透性增加促进了细胞内ROS的积累。因此,8-OHdG,一种DNA氧化产物,其浓度随着处理时间的延长不断增加(图3C)。此外,细菌SEM图像显示的细胞表面通透性和细胞内基质破坏变化进一步验证了细菌氧化损伤的增加(图4)。

LICAP对细菌E. coli (λ+)产生的氧化损伤

图3. LICAP对细菌E. coli (λ+)产生的氧化损伤

LICAP引起的细菌表面形态变化

图4. LICAP引起的细菌表面形态变化

等离子体诱导产生的活性自由基可以氧化细菌基因组进而激活细菌染色体上的前噬菌体。OES确定了在气相及气液界面产生的活性物种,这些活性物种可以转移到液体中或通过二次反应直接在液体中产生。通过EPR实验验证,强度比为1:2:2:1(红色实心方块)(图5A)和1:1:1:1:1(蓝色实心三角)(图5C)的信号表明分别存在·OH和·O2-,以及TEMP-1O2(1:1:1,绿色实心圆圈)(图5B)的典型三重峰的出现,表明在LICAP处理期间溶液中产生了1O2。此外,TEMPONE-H-ONOO-(1:1:1,红橙色倒三角)的峰值的出现(图5D)表明在LICAP处理期间存在ONOO-。另外,通过自由基淬灭实验发现,等离子体处理过程中,活性物种对原噬菌体激活的贡献遵循•OH > 1O2 > eaq- > •O2-> ONOO-(图5E)。

不同活性自由基物种对前噬菌体激活的贡献

图5. 不同活性自由基物种对前噬菌体激活的贡献

自然和工程系统中的生物膜中的微生物在基因型和表型上是多种多样的。因此,用优化的LICAP处理可渗透膜表面形成的生物膜,以测试我们的方法处理环境相关的生物膜的可行性。经过20分钟的LICAP处理,根据16S rRNA的定量分析,细菌的丰度下降了约49%(图6A)。荧光显微镜成像显示,等离子体处理后,噬菌体颗粒明显增加,VLPs增加了约6.80 ± 0.6倍(图6A)。一致的是,LICAP处理后,膜通量明显增加了4.33倍(图6A)。此外,病毒组分析显示,病毒组概况发生了实质性的变化,病毒contigs数量从1427增加到9378(图6B)。宏基因组分析显示,细菌丰度的主要减少归因于含有前噬菌体的溶原细菌(图6C)。经LICAP处理后,大量减少的细菌宿主可以与噬菌体相关联(图6D),表明LICAP激活了前噬菌体进入裂解周期,并进一步裂解了周围易感细菌宿主。因此,这项研究证实了基于前噬菌体激活和增殖的级联效应带来的“由内而外”的裂解策略代表了一种环境友好的细菌裂解和生物膜清除新方法。

膜过滤样品宏基因组和病毒组的概况

图6.膜过滤样品宏基因组和病毒组的概况