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成果简介
近日，中国科学院生态环境研究中心谭志强研究员和刘景富研究员团队在环境领域著名学术期刊Water Research上发表了题为“Insight into the formation and biological effects of natural organic matter corona on silver nanoparticles in water environment using biased cyclical electrical field-flow fractionation”的实验文章。文中使用了偏置循环电场流分级技术（BCyElFFF）对相同尺寸（40 nm）、不同修饰剂[聚乙二醇（PEG）和聚乙烯吡咯烷酮（PVP）]的银纳米颗粒（AgNPs）进行了分离。根据这两种不同修饰剂AgNPs洗脱时间差异、分级组分的离线分析表征以及理论计算结果，阐明了PEG-AgNPs和PVP-AgNPs表面NOM环境冠结构形成机理，揭示了NOM环境冠结构对AgNPs生物效应的影响机制。这项工作表明，BCyElFFF为监测AgNPs表面结构的微小变化以及高效分离纯化AgNPs及其衍生物（如表面含环境冠、蛋白冠等结构）提供了可靠技术支撑。
引言
电场流分级（Electrical field-flow fractionation，ElFFF）是场流分级技术的重要分支技术。在ElFFF分离过程中，目标物在电场作用下根据其电泳迁移率大小实现分级。由于ElFFF分离通道内没有固定相，这极大避免了尺寸排阻色谱分离中固定相和目标物之间的相互作用，非常适用于聚合物、生物大分子、纳米颗粒物等分离纯化。此外，ElFFF分离通道体积远大于毛细管电泳分离通道，因此进样量大，便于对分级组分的离线分析。为避免水电解产生气泡的干扰问题，传统ElFFF通常使用低于1.7 V的恒定直流电压。而在最新发展起来的偏置循环电场流分级技术（Biased cyclical ElFFF，BCyElFFF）分离过程中，高频偏置循环电场有效抑制了分离通道壁上双电层的形成，因此可以使用超过1.7 V的高电压，这大大提高了施加在分离通道的有效电场强度。因此，BCyElFFF非常有潜力识别和表征纳米颗粒表面结构的微观变化。基于此，本研究首先构建了BCyElFFF、紫外可见吸收光谱（UV/Vis）和电感耦合等离子体质谱仪（ICPMS）在线联用系统（BCyElFFF- UV/Vis- ICPMS）。在BCyElFFF最优分离条件下，研究了不同浓度天然有机质（NOM）对PEG-AgNPs和PVP-AgNPs保留时间的影响，收集了有/无NOM环境冠结构的PEG-AgNPs和PVP-AgNPs分级组分并进行了离线分析表征，计算了PEG单体、PVP单体、NOM特征官能团与AgNPs的结合能，阐明了PEG-AgNPs和PVP-AgNPs表面NOM环境冠的形成机制。在此基础上，研究了有/无NOM环境冠结构的PEG-AgNPs和PVP-AgNPs分级组分对大肠杆菌存活率的影响，揭示了NOM环境冠结构对这两种不同修饰剂AgNPs生物效应的影响机制。
图文导读
BCyElFFF分离机理
图1. BCyElFFF-UV/Vis-ICPMS在线联用系统结构图。
BCyElFFF整个分离过程包括进样、聚焦、洗脱等。在进样过程中，样品通过手动进样阀注入流路，然后被载流以0.25 mL/min的流速运送至BCyElFFF分离通道入口。0.7 min后，将载流流速降低至0 mL/min，打开直流电场，开启聚焦过程。在聚焦过程中，不同电泳迁移率的AgNPs在扩散和直流电场作用下，在距离分离通道蓄集壁不同位置达到稳态分布。1 min后，将载流流速迅速增加至0.25 mL/min，关闭直流电场，打开偏置循环电场，开启洗脱过程。在此过程中，AgNPs电泳迁移率大小决定了其洗脱顺序，通常低电泳迁移率颗粒比高电泳迁移率颗粒更早地从分离通道洗脱。从分离通道洗脱的AgNPs依次进入UV/Vis（410 nm）和ICPMS（107Ag）中进行定性和定量分析。
BCyElFFF分离条件优化
图2. 偏置循环电场电压(A)和频率(B)对PVP-AgNPs和PEG-AgNPs保留行为的影响
图2A表示，在较高电压下，PVP-AgNPs和PEG-AgNPs的保留比（R）值均显著降低，表明AgNPs的保留能力随着电压的增加而增强。在较高电压下，AgNPs在分离通道壁上的吸附导致样品峰面积值有降低趋势。在后续的实验中，选择2.5 V电压。
偏置循环电压频率是决定目标物在BCyElFFF通道中保留行为的另一重要参数。本文研究了频率为0.5~5 Hz范围内时PVP-AgNPs和PEG-AgNPs的保留比，如图2B所示。当频率从0.5增大到2 Hz，R呈现降低趋势，这表明AgNPs遵循模式I的分离模式（即目标样品在蓄集壁和分离通道中间位置之间来回振荡）。当频率高于2 Hz时， PEG-AgNPs和PVP-AgNPs峰均展宽且出现肩峰(如图3所示)，这有可能是由于在高频率时有效电场强度过高所致。因此，在接下来的实验中使用了1.0 Hz的频率。
图3. 不同频率下PEG-AgNPs (A)和PVP-AgNPs (B)的ICPMS场流分级图
探究PEG-AgNPs和PVP-AgNPs表面环境冠形成机理
图4A中的ICPMS场流分级图显示，随着NOM浓度的增加，PEG-AgNPs的洗脱时间明显增加。相比之下，图4B中所示的PVP-AgNPs的洗脱时间在较低的NOM浓度下基本保持不变，然后随着NOM浓度的增加而缓慢增加。这表明NOM与PEG-AgNPs和PVP-AgNPs表面的相互作用存在明显差异。如图4C所示，PEG-AgNPs的电泳迁移率绝对值随着洗脱时间的增加而显著增加，而PVP-AgNPs的电泳迁移率随NOM浓度的增加而缓慢增加，而PEG-AgNPs和PVP-AgNPs的水动力学粒径并无显著变化，这表明PEG-AgNPs和PVP-AgNPs的洗脱时间的变化与其电泳迁移率的变化密切相关。PEG和PVP分子分别通过含S和N的基团结合在AgNPs表面。其中，富含羟基的PEG单体更容易通过氢键和疏水效应与NOM（富含含氧官能团）分子发生相互作用，导致NOM更容易结合在PEG-AgNPs表面，这也通过高分辨透射电镜（HRTEM）表征结果得到了证实（图4D）。
图4. 不同浓度NOM条件下PEG-AgNPs（A）和PVP-AgNPs（B）的ICPMS场流分级图；(C)NOM浓度对PEG-AgNPs和PVP-AgNPs电泳迁移率的影响；(D)有/无NOM环境冠PEG-AgNPs和PVP-AgNPs的HRTEM照片
此外，作者采用X射线能谱仪对BCyElFFF分级组分中有/无NOM环境冠PVP-AgNPs和PEG-AgNPs表面的元素分布进行了表征。结果表明，NOM/PEG-AgNPs表面的N元素的质量百分比增加到5%左右，显著高于原始的PEG-AgNPs (0)；NOM/PVP-AgNPs表面的S元素的质量百分比增加到8.74%，是原始PVP-AgNPs中S元素质量百分比的3倍。以上结果表明，NOM在PEG-AgNPs和PVP-AgNPs表面形成了环境冠结构。
图5. NOM/PEG-AgNPs (A)和NOM/PVP-AgNPs (B)的HRTEM照片以及主要元素（Ag、C、N、O、S）分布图
探究环境冠对AgNPs的生物效应影响
最后作者选择大肠杆菌为模型生物，研究了BCyElFFF分级组分中的有/无NOM环境冠PVP-AgNPs和PEG-AgNPs对其存活率的影响。结果表明，NOM环境冠显著影响PEG-AgNPs和PVP-AgNPs对大肠杆菌生长的影响。特别是在高NOM浓度下，大肠杆菌的存活率提高到约88.3%和83.5%，显著高于原始PEG-AgNPs（62.8%）和PVP-AgNPs（58.1%）。本研究选用收集的BCyElFFF分级组分进行暴露，有效防止了样品中银离子、游离NOM等共存组分对研究结果的影响，为揭示AgNPs的生物效应提供了可靠技术手段。
图6. NOM浓度对PEG-AgNPs和PVP-AgNPs生物效应的影响
小结 本研究利用自主研制的BCyElFFF-UV/Vis-ICPMS在线联用系统，首次探究了水环境中相同尺寸、不同修饰剂AgNPs的环境冠形成过程以及环境冠结构对AgNPs生物效应的影响。研究表明，PEG-AgNPs和PVP-AgNPs表面环境冠厚度均随着NOM浓度的增加而增加。作者从有/无NOM环境冠AgNPs尺寸变化、颗粒表面元素分布以及PEG、PVP、NOM等分子与AgNPs结合能等多角度，证实NOM是直接结合在AgNPs颗粒表面而非取代PEG和PVP分子，这与报道的柠檬酸修饰AgNPs环境冠的形成机理显著不同。此外，具有NOM环境冠的AgNPs对大肠杆菌的致死率明显降低，且致死率降低程度与环境冠的厚度密切相关，作者推测这可能与NOM环境冠导致AgNPs与细菌膜之间的静电斥力和空间位阻增加有关。值得一提的是，BCyElFFF可以实现AgNPs及其衍生物（如含环境冠）的分离纯化，有效避免了共存物（如银离子、游离NOM组分等）对生物效应结果的影响，为水环境中含金属纳米颗粒的环境健康风险研究提供了关键技术支撑。
